szpital w zgorzelcu ul lubańska

W celu ustalenia, czy Bid jest odpowiedzialna za apoptozę indukowaną RANKL, zastosowaliśmy retrowirusowe podejście siRNA, stosując 2 różne sekwencje do powalenia ekspresji Bid w Rela. /. Prekursory OC. Poziomy ofert w Rela. /. BMM transdukowane retrowirusowymi spinkami siRNA zostały zmniejszone o 85% dla siBid1 i 55% dla siBid2 w porównaniu z tymi transdukowanymi z nieistotną lucyferazą ukierunkowaną na siRNA, siLuc (Figura 5B). Hodowla tego samego zestawu BMM w RANKL wykazała redukcję apoptozy z powrotem do poziomów Rela + / + (Figura 5C) i przywrócono numery OC po 6 dniach hodowli (Figura 5D). Ponadto, analiza resorpcji kości przez OC pochodzące z BMM transfekowanych siBid wykazała, że funkcja przetrwałych OC była nienaruszona (Figura 5, E i F). Stopień powalenia oferty korelował z ratowaniem apoptozy, różnicowania i funkcji. Tak więc, RelA sprzeciwia się proapoptotycznej ścieżce mediowanej przez JNK i Bid w prekursorach OC. Rycina 5Oblokowanie oferty ratowanie Rela. /. osteoklastogeneza. (A) Rela + / + i Rela. /. BMM stymulowano RANKL we wskazanych czasach, a całkowite lizaty komórkowe badano za pomocą immunoblot w celu wyrażenia Bid. P-aktyna została użyta jako kontrola obciążenia. (B) Rela. /. BMM transdukowano za pomocą retrowirusa eksprymującego 2 różne siRNA dla Bid (siBid1 i siBid2) lub lucyferazy (siLuc). Po selekcji puromycyną, poziomy Bid były badane przez immunoblot, demonstrując obniżenie Bid przez specyficzne siRNA. P-aktyna została użyta jako kontrola obciążenia. (C) Rela + / + i Rela. /. BMM transdukowane siLuc lub siBid1 lub -2 hodowano za pomocą RANKL przez 36 godzin i zmierzono fragmentację DNA. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. * P <0,05 versus Rela + / + siLuc. (D) Te same BMM w C hodowano w warunkach osteoklastogennych przez 6 dni, a następnie wybarwiano na obecność TRAP, wykazując uratowanie różnicowania za pomocą supozycji Bid. Pasek skali: 200 .m. (E) BMM hodowane na kortalnych odcinkach kości barwiono aglutyniną z kiełków pszenicy peroksydazą chrzanową w celu wykazania resorpcji. Pasek skali: 200 .m. (F) Dołki w E oznaczano ilościowo, pokazując, że zmniejszenie apoptozy koreluje z różnicowaniem i resorpcją kości. Czarne paski wskazują Rela + / +; szare paski wskazują Rela. / .; * P <0,05 versus Rela + / + siLuc. Ochrona przed apoptozą indukowaną przez RANKL jest specyficzna dla RelA, a nie dla RelB. Wcześniejsze badania dotyczące funkcji NF-kB w OUN, w tym nasze własne badanie NIK (8, 9), nie ustanowiły unikalnych ról dla poszczególnych podjednostek. W związku z tym zbadaliśmy wpływ RelA na aktywność wiązania RelB z B, kontrolowaną przez alternatywny szlak NF-kB, i c-Rel, kontrolowany klasyczną ścieżką NF-kB. W BMM stymulowanych RANKL poziomy aktywności wiązania RelBa są podobne w obecności i nieobecności RelA (Figura 6A), co wskazuje, że u tych myszy nie występuje uaktywnienie alternatywnego szlaku. Aktywność c-Rel wiążąca DNA B jest również niezmieniona w Rela. /. kultury w porównaniu z kulturami Rela + / +, co sugeruje, że c-Rel nie pełni tej samej funkcji co RelA. Rycina 6 Udoskonalona apoptoza wywołana RANKL jest specyficzna dla RelA. (A) BMM od Rela + / + i Rela. /. myszy hodowano w obecności M-CSF i RANKL przez 0 lub 24 godziny. Równe ilości ekstraktów jądrowych inkubowano z biotynylowanymi. Oligonami związanymi z kulkami opłaszczonymi streptawidyną. Kulki płukano w celu wyizolowania białek związanych z B, a te analizowano za pomocą immunoblotu dla RelB lub c-Rel. Niezwiązane białka jądrowe analizowano przez immunoblot dla Sp1 jako kontrola obciążenia. (B) BMM od Relb + / + i Relb. /. myszy hodowano z M-CSF i RANKL przez 48 godzin, a apoptozę oceniano za pomocą testu fragmentacji DNA, nie wykazując wpływu RelB na apoptozę. (C) Rela. /. BMM poddane retrowirusowemu transdukcji pustym wektorem (EV), RelA lub RelB i BMM Rela + / + transdukowane EV wybrano w blastocydinie, a następnie analizowano za pomocą immunoblot. Białka kodowane przez wirusy (zarówno RelA, jak i RelB) migrują wolniej niż ich odpowiedniki endogenne (endo) i są wyrażane 2- do 3-krotnie ponad poziomami endogennymi. (D) BMM transdukowane w C hodowano RANKL przez 48 godzin, a apoptozę oceniano za pomocą testu fragmentacji DNA. Podczas gdy kontrola EV i wektory RelB nie znoszą śmierci komórek wywołanej RANKL w Rela. /. w hodowlach, RelA redukuje apoptozę do tego samego poziomu, co Rela + / + transduced with EV. * P <0,001 Rela + / + EV. (E) Transdukowane BMM hodowano w warunkach osteoklastogennych przez 6 dni, a następnie utrwalano i barwiono pod kątem TRAP. Reexpression z RelA przywraca Rela. /. Rozróżnianie OC, natomiast nadekspresja RelB nie ma żadnego efektu [podobne: białe grudki w gardle, chlorek tionylu, naclof ]