Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości czesc 4

W oparciu o kryteria jakości określone w metodach można było ocenić 26 z 28 przypadków. Znaleźliśmy przyrost liczby kopii locus BRAF w 16 z 26 guzów (62%). Sześć z tych nowotworów (23%), wszystkie rozlane gwiaździakom, wykazało wzrost BRAF bez jednoczesnego uzyskania sondy centromerowej chromosomu 7, podczas gdy 10 nowotworów (38%, wszystkie 3 gwiaździaki pilocytowe i 7 gwiaździaków rozlanych) wykazywały równoczesne zwiększenie BRAF i centromerowe sondy chromosomowe, co wskazuje na duże zyski genomowe chromosomu 7 (dane nie pokazane). Hamowanie szlaku MAPK w liniach komórkowych gwiaździaka za pomocą inhibitorów MEK1 / 2. Element sygnalizujący MAPK MEK1 / 2 stanowi bezpośredni docelowy fosforylacji w dół dla BRAF. Fosforylacja MEK1 / 2 przez BRAF może być skutecznie blokowana in vitro za pomocą małocząsteczkowych inhibitorów, takich jak U0126. Traktowaliśmy 4 linie komórkowe ustalone z pierwotnych gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości lub oligoastrocytoma z U0126 i określiliśmy wpływ leczenia na aktywność szlaku MAPK i proliferację komórek. Jedna z tych linii komórkowych pochodziła od pacjenta pediatrycznego z gwiaździakiem pilocytarnym według WHO stopnia I, a 3 z dorosłych pacjentów z guzami stopnia II według WHO odpowiadającymi odpowiednio rozrostowi gwiaździakowi (1 przypadek) lub oligoastrocytoma (2 przypadki). Poza linią komórkową pochodzącą z gwiaździaka rozproszonego, wszystkie 3 inne linie komórkowe miały duży przyrost liczby kopii ramienia chromosomu 7q obejmującego locus BRAF, jak określono za pomocą macierzy CGH (dane nie przedstawione). Żadna z linii komórek nowotworowych nie wykazała aktywującej mutacji BRAF, podczas gdy wszystkie linie komórkowe wykazywały podobne poziomy mRNA BRAF i ekspresję białka (dane nie przedstawione). Stosując szeroki zakres różnych stężeń inhibitora MEK1 / 2 (zakres od do 20 ^ M), stwierdziliśmy znaczną redukcję proliferacji we wszystkich 4 liniach komórkowych (Figura 3, A i B). Biochemicznie, mogliśmy wykazać, że całkowite defosforylowanie ERK1 / 2 jest wykrywalne już po 30 minutach po inkubacji z 1. M inhibitora i jest utrzymywane przez co najmniej 24 godziny po podaniu pojedynczej dawki leku (Figura 3C). Poziom RNA kontrolnego w dół docelowego CCND1 MAPK zmieniał się w zakresie od 2,4 do 7,5 razy dla różnych linii komórkowych, osiągając maksimum po 24 godzinach (Figura 3D). Zmniejszona proliferacja po leczeniu U0126 została dodatkowo potwierdzona przez analizę cyklu komórkowego, ujawniając zatrzymanie w fazie G2 / M (Figura 4, A, C i E). Nie zaobserwowano indukcji apoptozy po leczeniu lekiem. Zostało to wykazane zarówno przez brak piku sub-G1 w analizie cyklu komórkowego (reprezentującego frakcję apoptotyczną komórek), jak i jedynie niewielki wzrost komórek dodatnich aneksyny V. Po leczeniu lekiem (Figura 4, B, D i FA). Rycina 3 Pafakologiczne hamowanie sygnalizacji MAPK w liniach komórkowych pochodzących z glejaków o niskim stopniu złośliwości. (A) Proliferacja komórek glejaka in vitro po potraktowaniu 4 różnych linii komórkowych pochodzących z pierwotnych glejaków o niskim stopniu złośliwości z inhibitorem MEK1 / 2 U0126 w stężeniu 20 .M, co oceniono za pomocą testu MTT w czasie 48 godzin. A ° II, gwiaździak rozproszony; OA, oligoastrocytoma. (B) Skuteczne zahamowanie wzrostu we wszystkich 4 liniach komórkowych można uzyskać w szerokim spektrum stężeń od 1. M do 20. M. Pokazano wartości mediany i odchylenie standardowe potrójnych pomiarów po 48 godzinach. (C) Defosforylacja ERK1 / 2 jest łatwo wykrywalna po 30 minutach i jest utrzymywana przez 48 godzin po podaniu pojedynczej dawki inhibitora w stężeniu .M. (D) Maksymalną obniżoną ekspresję mRNA CCND1 po traktowaniu inhibitorem MEK1 / 2 U0126 w stężeniu. M obserwowano po 24 godzinach. Figura 4Funkcjonalne analizy linii komórek glejaka o niskim stopniu złośliwości po farmakologicznym hamowaniu sygnalizacji MAPK. Analiza cyklu komórkowego przez pomiar zawartości DNA w komórkach NCH492 przed (A) i 48 godzin po traktowaniu 10. M U0126 (C). Komórki zostały zatrzymane w G2 / M po traktowaniu U0126 i nie miały piku subG1, co wskazuje na brak wzrostu apoptozy. Częstość wczesnego apoptozy została dodatkowo określona przez wybarwianie aneksyną V i tylko nieznacznie wzrosła 24 godziny po leczeniu lekiem (B i D). Puromycyna była stosowana jako kontrola pozytywna w indukcji apoptozy (E i F). Zatrzymanie cyklu komórkowego w liniach komórkowych gwiaździaka pilocytarnego po stabilnym wyciszeniu BRAF. Ponieważ gwiaździaki pilocytowe były głównym przedmiotem tego badania, mediowane lentiwirusem wyciszanie BRAF przez interferencję RNA przeprowadzono w linii komórkowej pochodzącej z gwiaździaka pilocytarnego. Ta linia komórkowa została również wybrana, ponieważ przenosi przyrost liczby kopii ramienia chromosomu 7q, w tym locus BRAF (dane nie pokazane)
[podobne: ug zaleszany, citodent kielce, węzły chłonne przyuszne ]