Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości cd

Ta konstelacja została znaleziona w 13 z 66 (20%) guzów (strzałka wskazuje na klony z przyrostem liczby kopii). (C) Array-CGH profil chromosomu 7 w innym gwiaździaku pilocytarnym z duplikacją locus BRAF w 7q34 (strzałka wskazuje na klony z przyrostem liczby kopii). (D) Duplikacja locus BRAF w gwiaździaku pilocytarnym ocenianym metodą FISH. Sonda pokrywająca locus BRAF (3 kopie) była oznaczona na zielono, a centromeryczna sonda kontrolna (2 kopie) na czerwono. Oryginalne powiększenie, × 100. Tabela Rozkład aberracji BRAF w podgrupach klinicznych Aktywacja mutacji w genie BRAF w gwiaździakach dziecięcych. Ponieważ aktywujące mutacje genu BRAF opisano w różnych jednostkach nowotworowych, badaliśmy wszystkie nowotwory uczestniczące w badaniu CGH w macierzy w celu aktywacji mutacji w eksonach, o których wiadomo, że przenoszą takie mutacje w nowotworach złośliwych (eksonach 11 i 15) i łagodnych (egzony 6, 12 i 14 w zespole CFC) przy użyciu denaturującej HPLC (DHPLC). Guzy wykazujące nieprawidłowy profil DHPLC następnie analizowano przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA. Wykryliśmy mutacje punktowe wpływające na kodon 600 gorącego miejsca w eksonie 15 BRAF w 4 z 66 gwiaździaków pediatrycznych (6%, dane nie przedstawione), wszystkie niosące tę samą mutację, V600E. Ta dobrze ugruntowana mutacja aktywująca została znaleziona w 3 gwiaździakach pilocytarnych i rozlanym gwiaździaku. DNA limfocytów otrzymane od tych samych pacjentów nie miało tych mutacji, wykluczając w ten sposób obecność mutacji linii zarodkowej (dane nie pokazane). Co ciekawe, żaden z 4 nowotworów BRAF nie posiadał duplikacji locus BRAF, ale ze zmutowanych guzów pilocytowych wykazywał trisomię chromosomu 7. W tym konkretnym przypadku dodatkowo badaliśmy nawrotowy nowotwór, który nadal nosił mutację BRAF, ale utraciły trisomię chromosomu 7 (dane niepokazane). Ekspresja BRAF i jego docelowej sekwencji CCND1 w gwiaździakach dziecięcych. Poziomy ekspresji mRNA BRAF mierzono za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym w tych gwiaździakach pilocytarnych, z których dostępne było wysokiej jakości RNA. Łącznie zbadano 5 guzów ze zrównoważonym locus BRAF i 8 guzów z małymi przyrostami liczby kopii locus BRAF. Znormalizowane poziomy transkryptów BRAF były 1,4- do 7,3-krotnie wyższe w gwiaździakach pilocytarnych w porównaniu z nienowotworową tkanką mózgową połączoną z 5 różnymi osobnikami. Mediana ekspresji mRNA BRAF w guzach z powieleniem BRAF była 2-krotnie wyższa w porównaniu z nowotworami ze zrównoważonym stanem BRAF (Figura 2A, P = 0,01). W tych samych nowotworach mierzono poziomy ekspresji transkryptów CCND1, które kodują cyklinę D1, dobrze ustalony gen docelowy sygnalizacji MAPK. Poziomy mRNA CCND1 wahały się od 0,78 do 55 razy w gwiaździakach w porównaniu z nienowotworową tkanką mózgową. Mediana poziomu ekspresji mRNA CCND1 była 3,7-krotnie wyższa w guzach z powieleniem BRAF niż w guzach bez tej wady (Figura 2B, P = 0,008). Sześć próbek guza z duplikacjami BRAF zbadano za pomocą analizy Western blot i wszystkie wykazały wyższą całkowitą ekspresję białka BRAF i zwiększoną fosforylację ERK1 / 2 w porównaniu z nienowotworową tkanką mózgową (Figura 2C). Figura 2 Ekspresja BRAF i CCND1 w pierwotnych gwiaździakach pilocytarnych. (A) Poziomy ekspresji mRNA BRAF w 5 gwiaździakach pilocytarnych z 2 kopiami BRAF (po lewej) i 8 gwiaździakami pilocytarnymi z 3 kopiami BRAF z powodu duplikacji genów (po prawej) w odniesieniu do poziomów transkryptu BRAF w nienowotworowej tkance mózgowej. Należy zauważyć, że średni poziom ekspresji mRNA BRAF jest znacząco wyższy w guzach z powieleniem BRAF w porównaniu z nowotworami bez tej wady (P = 0,01). (B) Ekspresja mRNA CCND1 w tych samych guzach. Średnie poziomy ekspresji mRNA CCND1 są istotnie wyższe w guzach z powieleniem BRAF niż w guzach z 2 kopiami genów (P = 0,008). (C) Analiza Western blot wykazująca ekspresję białka BRAF (górny panel) i fosforylację ERK1 / 2 (pERK1 / 2, środkowy panel) w 6 nowotworach z duplikacją BRAF (ścieżki 2. 7) i w nieneoplastycznej tkance mózgowej (linia 1, połączone białko frakcje z 5 próbek tkanki mózgowej od 5 różnych osobników) wykazujących, że BRAF ulega ekspresji wyłącznie w nowotworach i zawsze wiąże się z aktywacją sygnalizacji MAPK. Całkowite białko ERK1 / 2 zastosowano jako kontrolę obciążenia (ERK1 / 2, dolny panel). nb, normalny mózg; PA, gwiaździak pilocytowy. Analiza FISH locus BRAF w dojrzałych gwiaździakach pilocytowych i rozlanych. Aby zbadać wpływ aberracji liczby kopii na locus BRAF w dojrzałych gwiaździakach pilocytarnych i rozlanych, zbadaliśmy 28 guzów (3 gwiaździaki pilocytowe, 25 rozlanych gwiaździaków) metodą FISH na mikromacierzy tkankowej (TMA)
[patrz też: ug zaleszany, wena oława, luzer ]