Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości ad 9

Przeciwciała wtórne skoniugowane z peroksydazą chrzanową (Abcam) zastosowano w rozcieńczeniu 1: 10000 przed chemiluminescencyjnym wykrywaniem białka (zestaw ECL Plus, GE Healthcare). Test proliferacji. Aby ocenić proliferację komórek glejaka in vitro przed i po traktowaniu inhibitorem MEK1 / 2 U0126, zastosowano oparte na MTT CellTiter96 AQ Nieradioaktywne Proliferacja Komórkowa (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. Wszystkie próbki badano w trzech powtórzeniach, a doświadczenia przeprowadzono w 2 biologicznych replikach. U0126 stosowano w stężeniach od 1. M do 20. M. DMSO zastosowano jako kontrolę ujemną. Głodzenie w surowicy wykonywano przez 4 godziny przed każdym eksperymentem. Analiza cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej. Analizę cyklu komórkowego wykonano 24 godziny po leczeniu lekiem U0126. Komórki utrwalono etanolem i zawartość DNA badano przez barwienie przez 30 minut w temperaturze pokojowej roztworem zawierającym 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 20 .g / ml jodku propidyny (Invitrogen) i 0,2 mg. / ml wolnej od DNazy RNazy A (QIAGEN). Komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu FACSCanto II (BD). Oprogramowanie FACSDiva (BD) zastosowano do ilościowego określenia rozkładu komórek w każdej fazie cyklu komórkowego: pod-G1 (komórki apoptotyczne), G1, S i G2 / M. Wykrywanie wczesnej apoptozy poprzez barwienie aneksyną V. Fosfatydyloserynę eksternalizacyjną jako pomiar do wczesnej apoptozy analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki inkubowano z aneksyną V FITC (BD) i jodkiem propidyny (Invitrogen) przez 15 minut w ciemności, a następnie bezpośrednio za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem FACSCanto II (BD). Analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania FACSDiva. Wyciszanie BRAF przez lentiwirusową transdukcję shRNA. Wektory lentiwirusowe wytworzono przez kotransfekcję komórek HEK293T z konstruktami psPAX2, pMD2.G i pLKO.1 (MISSION TRC-Hs 1.0, pozycja 56). Transfekcje przeprowadzono przy użyciu FuGENE 6 (Roche). Wirus zbierano 48 i 72 godziny po transfekcji, a infekcje komórek NCH492 prowadzono w obecności 8 .g / ml polibrenu. Supernatant zawierający wirusa usunięto po 24 godzinach. Po transdukcji komórki selekcjonowano za pomocą 2,5 .g / ml puromycyny. Zastosowano pięć niezależnych konstruktów shRNA ukierunkowanych na różne regiony transkryptu mRNA BRAF: MISJA shRNA NM_004333.2-1106s1c1 (shRNA1); NM_0043,23,2-838s1c1 (shRNA2); NM_004333.2-2267s1c1 (shRNA3); NM_004333.2-1538s1c1 (shRNA4); i NM_004333.2-304s1c10 (shRNA5). Nie kierowania shRNA użyto jako kontroli. Dodatkowe materiały Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Z wdzięcznością dziękujemy Leonore owi Senfowi za zbieranie i utrzymywanie banku guza mózgu w departamencie W. Scheurlena. Bank tkanek guza mózgu GPOH dostarczył próbki guza i dane kliniczne do tego badania. Stefanie Hofmann jest uznawany za doskonałą pomoc techniczną. Przypisy Niestandardowe skróty: tablica-CGH, CGH bazujący na macierzy; CGH, porównawcza hybrydyzacja genomowa; DHPLC, denaturująca HPLC; MTT, bromek 3- [4,5-dimetylotiazol-2-ilo] -2,5-difenylotetrazoliowy; NF1, neurofibromatoza typu 1; TMA, mikromacierz tkankowy. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.118: 1739. 1749 (2008). doi: 10.1172 / JCI33656 Stefan Pfister, Wibke G. Janzarik i Marc Remke w równym stopniu przyczynili się do tej pracy.
[hasła pokrewne: esteticmed bydgoszcz, limitki aflofarm, kardiomed ursus ]