Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości ad 8

Ekstrakcję DNA i RNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym z próbek zamrożonego guza przeprowadzono za pomocą metody wysalania (47) lub przez ultrawirowanie chlorku cezu, jak opisano wcześniej (48). Genomowy DNA z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej zdrowych dawców (pula 10 dawców, przedział wiekowy, 25. 40 lat dla każdej płci) izolowano przy użyciu zestawu QIAGEN DNA Blood Midi-Kit. Jakość DNA oceniano na 1% żelu agarozowym, a całkowitą jakość i stężenie RNA kontrolowano za pomocą bioanalizera Agilent 2100 (Agilent Technologies). Porównawcza hybrydyzacja genomowa. Array-CGH przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (26, 49, 50). Selekcja klonów genomowych, izolacja DNA BAC, wydajność zdegenerowanego startera PCR z oligonukleotydem, przygotowanie mikromacierzy, znakowanie, hybrydyzacja i procedury płukania, jak również analiza danych zostały przeprowadzone jak wskazano w innym miejscu (49, 50). Znormalizowane współczynniki log2, a także surowe zbiory danych z tego badania zostały zdeponowane w NCBI Gene Expression Omnibus (numery dostępu GSE8737 i GPL5713). Statystyka. Aby ocenić związek pomiędzy stanem liczby kopii BRAF a podgrupami klinicznymi, obliczono tablice kontyngencji 2D i zastosowano 2-stronne testy. 2. Wynik uznano za znaczący przy P <0,05. Obliczenia statystyczne przeprowadzono w środowisku oprogramowania statystycznego R, wersja 2.6.1. RYBA. Dwukolorową interfazę FISH przeprowadzono przy użyciu sond FITC (RP4-726N20) i znakowanych rhodaminą (p7t1), lokalizujących w interesującym locus (7q34; BRAF) i centromerach chromosomu 7, odpowiednio (51). Wstępne traktowanie szkiełek, hybrydyzację, obróbkę po hybrydyzacji i detekcję sygnału przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (52). Próbki wykazujące wystarczającą skuteczność FISH (> 90% jąder z sygnałami) zostały ocenione przez 2 niezależnych badaczy. Sygnały zostały ocenione w co najmniej 50 nienaruszających się, nienaruszonych jądrach. Metafazę FISH do weryfikacji pozycji mapowania klonów przeprowadzono przy użyciu hodowli zdrowych dawców z krwi obwodowej, jak opisano wcześniej (53). Mutacyjna analiza przez DHPLC i sekwencjonowanie genomowe. Genomowy DNA amplifikowano za pomocą zestawu GenomiPhi (GE Healthcare). Mutacyjna analiza skupiała się na tych genomowych fragmentach BRAF, które wcześniej wykazywały mutacje aktywujące (15, 16, 21). Specyficzne intronowe pary starterów użyto do amplifikacji PCR egzonów 6, 11, 12, 14 i 15. Sekwencje starterów są dostępne w Tabeli dodatkowej 4. Do skriningu mutacji stosowano DHPLC. Produkty PCR wykazujące nienormalny profil DHPLC były dalej badane przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA. Każdą mutację wykrytą w amplifikowanej próbce DNA potwierdzono przez niezależne sekwencjonowanie odpowiedniego nieampampodowanego DNA nowotworowego. Przygotowanie TMA i immunohistochemii. Opracowano niestandardową TMA do badania gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości od dorosłych. Skrawki wybarwione H & E ze wszystkich bloków parafiny przygotowano w celu identyfikacji reprezentatywnych regionów nowotworowych, jak opisano wcześniej (54). Wszystkie wycinki zostały zestawione w trzech powtórzeniach, gdy dostępna była wystarczająca ilość materiału. Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Aby zmierzyć obfitość mRNA BRAF i CCND1 w nowotworach, zastosowano odniesienie do całkowitego RNA uzyskanego z nieneoplastycznych próbek ludzkiej tkanki mózgowej u 5 osobników (przedział wiekowy, 26. 82, BioChain) do normalizacji tkankowo-specyficznej. Każdą próbkę cDNA analizowano w trzech powtórzeniach za pomocą ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) stosując Absolute SYBR Green ROX Mix (ABgene) zgodnie z instrukcjami producenta. Dwa endogenne geny uspokajające (PGK1, DCTN2) zastosowano jako standardy wewnętrzne. Geny te nie były regulowane w eksperymentach profilowania ekspresji porównujących podgrupy gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości. Co więcej, testowano je w prawidłowych tkankach z całego mózgu i móżdżku, gdzie wykazywały one bardzo małą zmienność. Wszystkie startery testowano w celu wykluczenia amplifikacji z genomowego DNA. Względna kwantyfikacja RNA będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu z genami utrzymującymi porządek obliczono zgodnie z wcześniej opublikowanym algorytmem, z modyfikacją, że w niniejszym badaniu użyto 2 genów uspokajających (55). Sekwencje oligonukleotydowe są dostępne w Tabeli dodatkowej 5. Western blotting. Frakcje białkowe otrzymane w wyniku ultrawirowania chlorkiem cezu najpierw poddano dializie wobec PBST przez noc, stosując kubek do dializy Slide-a-Lyzer MINI (Pierce Biotechnology) w celu zubożenia pozostałego chlorku cezu. Poliklonalne królicze przeciwciało przeciwko p44 / 42 (stosowane jako kontrola obciążenia, Cell Signaling Technology), monoklonalne królicze przeciwciało przeciwko fosfo-p44 / 42 (Cell Signaling Technology) i monoklonalne królicze przeciwciało przeciwko BRAF (Abcam) były wszystkie stosowane w stosunku 1: 1000 rozcieńczenia
[przypisy: kardiomed ursus, limitki, danmed oborniki ]