Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości ad 7

Aby zbadać swoistą rolę BRAF w gwiaździakach pilocytowych, wyciszyliśmy BRAF w linii komórkowej pochodzącej z gwiaździaka pilocytarnego, który przenosi przyrost liczby kopii ramienia chromosomu 7q. Według naszej wiedzy, jest to pierwsze sprawozdanie z analiz funkcjonalnych wykonanych w ustalonej linii komórkowej pochodzącej z gwiaździaka pilocytarnego do tej pory. Powalenie przeprowadzono za pomocą lentiwirusowej transdukcji 5 różnych shRNA skierowanych na różne regiony w transkrypcie BRAF i porównano z transdukcją kontrolną przy użyciu niedotyczącego shRNA. Uderzająco, 2 z 5 shRNA spowodowało praktycznie całkowite zahamowanie proliferacji komórek, tak że nie można było przeprowadzić kolejnych analiz funkcjonalnych. Pozostałe 3 shRNA spowodowały głębokie zahamowanie proliferacji komórek bez widocznych zmian w morfologicznym wyglądzie komórek nowotworowych. Analiza funkcjonalna wykazała akumulację komórek w fazie G2 / M cyklu komórkowego i brak dowodów na znaczny wzrost apoptozy. Podsumowując, zidentyfikowaliśmy mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości poprzez duplikację locus genu BRAF. Powoduje to nadekspresję BRAF na poziomie mRNA i białka oraz kolejną aktywację dalszych elementów sygnalizacyjnych. Ponadto, stwierdziliśmy, że niewielki procent gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości u dzieci nosi mutacje punktowe BRAF jako alternatywny mechanizm molekularny do aktywacji szlaku MAPK. Inne zmiany w tych nowotworach mogą aktywować tę samą ścieżkę, taką jak nadekspresja receptorów czynnika wzrostu kinazy tyrozynowej, np. Receptora PDGF. (46), lub w rzadkich przypadkach, inaktywacja NF1 lub aktywacja mutacji KRAS. Tak więc, nienormalna sygnalizacja MAPK ma pierwszorzędne znaczenie w patogenezie gwiaździaków pilocytarnych i rozproszonych. Fakt, że właściwie wszystkie gwiaździaki o niskim stopniu złośliwości wykazują aktywację dalszych efektorów MAPK sugeruje, że ukierunkowane farmakologiczne hamowanie tego szlaku może stanowić obiecujące podejście w leczeniu tych nowotworów. Metody Materiał nowotworu. Większość próbek gwiaździaka od dzieci (n = 41) zebrano w latach 1994-2002 w Klinice Onkologii Dziecięcej, Szpitalu Uniwersyteckim w Würzburgu (Würzburg, Niemcy) i Klinice Onkologii Dziecięcej, Szpital Uniwersytecki w Mannheim (Mannheim, Niemcy) . Uzyskano świadomą zgodę na wszystkie próbki guza od pacjenta lub prawnego opiekuna. Wszystkie rozpoznania zostały potwierdzone przez ocenę histologiczną próbek pobranych w neurochirurgii przez co najmniej 2 neuropatologów zgodnie z kryteriami klasyfikacji WHO. Zatwierdzenie połączenia danych histologicznych z danymi klinicznymi uzyskano z Institutional Review Board na Uniwersytecie w Würzburgu. Zbieranie i wykorzystywanie próbek guza przeprowadzono zgodnie z oficjalnym oświadczeniem Krajowej Rady Etycznej rządu federalnego Niemiec (marzec 2004 r.). Dodatkowe próbki tkanki nowotworowej dla dzieci (n = 25) uzyskano z banku tkanki nowotworowej mózgu niemieckiego Towarzystwa Hematologii i Onkologii Dziecięcej (GPOH). Zatwierdzenie połączenia danych histologicznych z danymi klinicznymi uzyskano dla wszystkich próbek pobranych w określonym banku guza z Komitetu Etycznego Uniwersytetu w Bonn, w którym zlokalizowany jest bank guza. Charakterystykę pacjentów wszystkich próbek badanych przez macierz-CGH przedstawiono w Tabeli 2. Próbki nowotworów gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości (n = 28) od dorosłych pacjentów, w tym 3 gwiaździaki pilocytowe i 25 rozlanych gwiaździaków, zebrano w latach 1996-2004 na oddziale Neurochirurgii Uniwersytetu w Heidelbergu. Zatwierdzenie połączenia danych histologicznych z danymi klinicznymi zostało uzyskane przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Heidelbergu. Świadoma zgoda została uzyskana od pacjentów bezpośrednio lub, w przypadku nieletnich, od ich rodziców lub prawnych opiekunów. Charakterystyka pacjentów odpowiadająca tym próbkom została przedstawiona w Tabeli dodatkowej 1. Stałe linie komórkowe z pierwotnych hodowli komórkowych zostały ustalone na pacjentach pediatrycznych z gwiaździakiem pilocytarnym (stopień I wg WHO, NCH492) i 3 dorosłymi pacjentami z gwiaździakiem rozlanym (stopień II wg WHO; NCH134) lub oligoastrocytoma (WHO stopień II, NCH480b i NCH514) leczony w Klinice Neurochirurgii Uniwersytetu w Heidelbergu. Wszystkie pierwotne hodowle były namnażane in vitro przez 50 pasaży lub więcej przy stosunku podziału 1: 6 do 1:10. Eksperymenty in vitro dla tego badania przeprowadzono w pasażach odpowiednio 53, 10, 11 i 54. Całkowite RNA i całkowite białko wyekstrahowane z nieneoplastycznej tkanki mózgowej (składające się z puli próbek tkanek od 5 dawców, przedział wiekowy, 26. 82 lat) zakupiono od BioChain. Tabela 2 Dane kliniczne dotyczące guzów dziecięcych Izolacja kwasu nukleinowego
[więcej w: usg agatowa, igor michajłowski, luzer ]