Powielanie genu BRAF stanowi mechanizm aktywacji szlaku MAPK w gwiaździakach o niskim stopniu złośliwości ad 5

Używając 5 różnych shRNA celujących w BRAF, uzyskano skuteczność knockdown między 80% a 95%, jak oceniono za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (dane nie pokazane). Nie kierowania shRNA użyto jako kontroli. Stabilna transdukcja z 2 shRNA (shRNA4 i shRNA5) spowodowała praktycznie całkowite zahamowanie proliferacji, co uniemożliwiło dalsze analizy. W komórkach o stabilnej ekspresji z 3 innych shRNA przeciwko BRAF lub nie kierowania shRNA, szybkość proliferacji oznaczano za pomocą testów na bromku 3- [4,5-dimetylotiazol-2-ilo] -2,5-difenylotetrazoliowym (MTT). Równe ilości komórek plasowano 24 godziny przed analizą. Proliferacja była znacząco i powtarzalnie niższa we wszystkich liniach komórkowych wyciszonych przez BRAF (Figura 5A). Efekt ten był również widoczny podczas mikroskopowego badania komórek po 24 godzinach (Figura 5B). Jak wykazano w przypadku leczenia U0126, komórki były zatrzymywane w cyklu komórkowym w fazie G2 / M po wyciszeniu BRAF, co wskazuje na niebędną rolę BRAF w sygnalizacji MAPK w nowotworach astrocytarnych. Figura 5Stabilne wyciszanie ekspresji BRAF w komórkach gwiaździaka pilocytarnego. (A) Proliferacja gwiaździstych komórek gwiaździaka NCH492 po shRNA, w którym wyciszono BRAF przy użyciu 3 różnych shRNA, jak oceniono za pomocą testu MTT 24 godziny po wysianiu równej liczby komórek. Jako referencję zastosowano nie kierowanie shRNA. Zaobserwowano ostre zahamowanie wzrostu dla wszystkich 3 shRNA skierowanych przeciwko BRAF. Słupki błędów przedstawiają SD między replikatami. (B) Badanie mikroskopowe tych samych próbek w czasie analizy MTT wykazujące zatrzymanie wzrostu komórek po knoksie BRAF. Oryginalne powiększenie, × 10. (C. F) Analiza cyklu komórkowego 24 godziny po wysianiu równej liczby komórek niosących nie kierowane shRNA (C) lub jeden z shRNA celujących w BRAF (D. F). Jak zaobserwowano w przypadku leczenia inhibitorem MEK1 / 2, komórki kumulowały się w fazie G2 / M cyklu komórkowego. Dyskusja Sygnalizacja MAPK w raku. Kaskada sygnalizacyjna RAS / RAF (MAPK) jest jedną z najważniejszych dróg regulacji wzrostu komórek, proliferacji, różnicowania i apoptozy w komórkach nowotworowych i niezłośliwych. BRAF, bezpośredni docelowy cel białek Ras, został zidentyfikowany jako częsty cel aktywacji mutacji w zmianach przedrakowych, np. Hiperplastycznych polipach okrężnicy i dużych znamionach wrodzonych (29, 30). Ponadto, aktywację onkogenną za pomocą mutacji punktowych, translokacji lub inwersji zaobserwowano w około 60% przypadków złośliwych czerniaków, 50% raków tarczycy i 15% raków jelita grubego i jajnika (21, 31. 35). W glejakach dorosłych w poprzednich badaniach wykryto mutacje BRAF w niewielkiej części glejaka (36, 37) i odnotowano pojedynczy przypadek oligodendroglei (38). Ponadto stwierdzono, że rzadkie przypadki glejaków przenoszą mutacje w NRAS (36, 38), podczas gdy duże przyrosty liczby kopii obejmujące geny szlaku MAPK wykryto w analizie chromosomalnej CGH w 38 z 87 glejaków (44%) zbadanych (38) . W niniejszym badaniu systematycznie badano gwiaździaki rozlane gwiaździakowe o niskim stopniu złośliwości u dzieci z zaburzeniami równowagi genomowej przy użyciu macierzy CGH o wysokiej rozdzielczości i zidentyfikowaliśmy częste duplikowanie genu BRAF, co uważamy za nowy mechanizm prowadzący do aktywacji szlaku MAPK u pacjentów z zaburzeniami czynności nerek. gwiaździaki stopnia. Onkogenna aktywacja BRAF poprzez duplikacje genów lub mutacje aktywujące w gwiaździakach dziecinnych o niskim stopniu złośliwości. Nasza analiza matrycowo-CGH 53 gwiaździaków pilocytowych i 13 rozlanych u dzieci wykazała, że nierównowaga liczby kopii jest w tych nowotworach nieczęsta. Odkrycie to jest zgodne z wynikami ostatnio opublikowanego badania CGH w układzie 44 z gwiaździakami pilocytarnymi, które nie wykryły żadnych zmian liczby kopii w 64% przypadków przy użyciu macierzy BAC o średniej rozdzielczości Mb (10). Co ciekawe, w tym badaniu wykazano, że wzrosty chromosomów były znacznie częstsze, a liczba chorych chromosomów znacząco wzrosła u pacjentów w wieku powyżej 15 lat. W naszej kohorcie tylko 3 z 66 pacjentów (5%) miało od 15 do 18 lat, z przeciętnie 2 aberracjami liczby kopii na guz. Zidentyfikowaliśmy jednak ograniczone duplikacje w 7q34 jako znaczącą aberrację w gwiaździakach i gwiaździakach rozlanych z populacji dziecięcej, z ogólną częstotliwością 45% w badanej populacji i częstością 53% w podgrupie gwiaździaka pilocytarnego. BRAF został wybrany z 12 genów kodujących zawartych w tym regionie, będąc najbardziej prawdopodobnym kandydatem na onkogen. Dalsze wzmocnienie tego założenia, odkryliśmy mutacje aktywujące BRAF w kodonie 600 w 6% guzów, z mutacją BRAF i powielaniem się wzajemnie wykluczającym
[przypisy: węzły chłonne przyuszne, ug zaleszany, esteticmed bydgoszcz ]