orthopedica kraków

Genotyp wszystkich użytych myszy potwierdzono przez analizę PCR genomowego DNA ekstrahowanego z biopsji ogona. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Studiów nad Zwierzętami w Washington University School of Medicine. Przeszczep szpiku kostnego. Odbierające 3- do 5-tygodniowe myszy C57BL / 6J (The Jackson Laboratory) podawano 10 Gy całkowitego ciała na dzień przed wstrzyknięciem x 106 komórek szpiku kostnego z Rela + / + Tnfrl. /. lub Rela. /. Tnfr1. /. dawców za pośrednictwem żyły ogonowej. Wszczepienie przeszczepionego szpiku zostało potwierdzone przez Western blot dla RelA (dane nie pokazane) na BMM pochodzących z RC. Transfer artretyzmu w surowicy. Zapalenie stawów indukowano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 250. LK / BxN surowicy w dniach 0, 2 i 7, 50. G LPS (E. coli 011, B4, Sigma-Aldrich) w dniu 2, jak opisano (9). Grubość kostki w tylnych łapach mierzono za pomocą czujnika zegarowego (Mitutoyo). Leczenie RANKL in vivo. Rela + / + i Rela. /. RC wstrzyknięto podskórnie GST-RANKL (500 .g na dzień przez 5 dni) lub PBS (pozorowane). Pomiar surowicy TRAP5b i CTX. Bezpośrednio przed uśmierceniem myszy znieczulono i pobrano krew z orbitali. Po krzepnięciu i odwirowaniu, surowicę zebrano i przechowywano w temperaturze <80 ° C przed analizą z użyciem testu Mouse TRAP (IDS Inc.) lub CTX (Rat Lap Elisa, Nordic Bioscience Diagnostic) zgodnie z instrukcjami producenta. Histomorfometria kości. Kręg miażdżysty lędźwi, calvariae lub stawy kostne zostały utrwalone przez noc w formalinie i odkamieniane w 14% EDTA. Skrawki zatopione w skórze zostały wybarwione H & E lub aktywności TRAP. Sekcje kości zostały zakodowane przed analizą. Objętość kości beleczkowatej (BV / TV), powierzchnie OC (Oc.S / BS.) I numery OC (N.Oc./B.Pm.) Zostały zmierzone przez obserwatora oślepionego genotypem zgodnie ze standardowym protokołem z użyciem Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation). Kultura OC. BMM otrzymano i zróżnicowano w OC, jak opisano (34), stosując CMG14-12 jako źródło M-CSF i rekombinowanego GST-RANKL. Do osteoklastogenezy w płytkach 96-studzienkowych, BMMs z Rela. /. i myszy Rela + / + wysiano w 5 x 103 i hodowano z 30 ng / ml M-CSF (supernatant 1:50 CMG). Po 5 do 6 dniach studzienki utrwalono 4% paraformaldehydem i OC wizualizowano przez histochemiczne barwienie dla aktywności TRAP zgodnie z instrukcjami producenta (Sigma-Aldrich). Do eksperymentów z hodowlą, ocynkowanych OC i BMM od Rela. /. i myszy Rela + / + mieszano w stosunku 1: 2 i hodowano przez 7 dni w obecności 1,25 witaminy D3 (10. 8 M) (Sigma-Aldrich). Barwienie w jamie kostnej. BMM różnicowano na kortach kości korowej bydła za pomocą RANKL przez 7. 8 dni. Barwienie luki resorpcyjnej przeprowadzono jak opisano wcześniej (35). Pokrótce, komórki usunięto z wycinków kości przez przetarcie powierzchni kawałków kości miękką szczotką, następnie plastry przepłukano, inkubowano z 20 .g / ml aglutyniny kiełków pszenicy sprzężonej z peroksydazą (Sigma-Aldrich) przez 30 minut, i opracowano za pomocą 3, 3P-diaminobenzydyny przez 15 minut. Test MTT. BMM hodowano w M-CSF, z lub bez GST-RANKL, przez 3 do 48 godzin, a liczbę żywotnych komórek mierzono przez dodanie 10. L MTT 5 mg / ml (3-4, 5-dimetylotiazol-2y- 2,5 bromku difenylotetrazoliowego, Sigma-Aldrich) do 200 ul pożywki hodowlanej w każdej studzience i inkubowane w 37 ° C przez 4 godziny. Aby zatrzymać reakcję, do każdej studzienki dodano 150 .l 0,04 N HCl w izopropanolu i określono absorbancję przy 570 nm. Test fragmentacji DNA. Test wykrywania śmierci komórki przeprowadzono przy użyciu zestawu Cell Death Detection Elisa (Roche Diagnostics Corp.) zgodnie z instrukcjami producenta. Rela + / + i Rela. /. BMM hodowano w 96-studzienkowych płytkach przez 36. 48 godzin w obecności M-CSF (supernatant 1:50 CMG) i GST-RANKL (150 ng / ml), z lub bez 10. M ZVAD-FMK (R & D Systems ) lub inhibitor JNK, SP600125 (1,0. M) (Calbiochem) przed lizą. Absorbancję odczytano przy 405 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Bio-Rad. Testy fluorymetryczne aktywujące kaspazę. Aktywację kaspazy-3, -8 lub -9 mierzono zgodnie z protokołem odpowiednich zestawów fluorometrycznych (Biovision). Komórki w zawiesinie zebrano przez odwirowanie i zmieszano z komórkami przylegającymi do lizy. Substraty to DEVD-AFC (kaspaza-3), FLICE (kaspaza-8) i LEHD-AFC (kaspaza-9). Fluorescencję odczytano za pomocą Spectra Fluor (Tecan) z filtrem pobudzającym 400 nm i filtrem emisyjnym 505 nm. Transdukcja retrowirusowa. Retrowirus wygenerowano przez klonowanie mysiego relA (z N-końcowym znacznikiem HA) lub cDNA relB do wektora pMX-IRES-bsr przystosowanego do systemu klonowania Gateway (Invitrogen) i transfekowano do komórek pakujących PlatE, stosując Transfectol (Gene Choice) [patrz też: kardiomed ursus, danmed oborniki, wok brodnica ]