Mysi model zespołu Costello ujawnia stan nadciśnienia z udziałem III Ang ad

Aby wytworzyć model mysie dla CS, celowaliśmy w komórki ES przez wywołanie w onkogennej mutacji genu T w drugiej podstawie dwunastego kodonu locus H-Ras (Suplementowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; : 10,1172 / JCI34385DS1). Ta strategia umożliwiła zastąpienie normalnej sekwencji GGA (Gly) GTA (Val), mutacją wykrytą u wielu pacjentów z CS, co prowadzi do ekspresji konstytutywnie aktywnego białka H-RasG12V (5). Aby monitorować ekspresję H-Ras na poziomie pojedynczej komórki, wstawiliśmy również w obrębie 3. nieulegające translacji sekwencje genu H-Ras, wewnętrzną kasetę do białka rybosomalnego, wejściową rybosomalną, oporną na .-globomycynę (IRES. – geo) (Suplementowa Figura 1). Te dodatkowe sekwencje umożliwiły ekspresję chimerycznego białka o aktywności p-galu pod kontrolą endogennego promotora protoonkogenu H-Ras, umożliwiając w ten sposób histologiczne wykrywanie wzorców ekspresji genów przy użyciu metod barwienia X-gal (28). Te zmutowane myszy, oznaczone jako H-Ras + / G12V, urodziły się w oczekiwanym stosunku Mendelianów, były płodne i przetrwały w tempie porównywalnym z ich odpowiednikami typu dzikiego przez ponad rok. Podobne wyniki zaobserwowano dla zwierząt homozygotycznych H-RasG12V / G12V. Myszy H-Ras + / geo i H-Rasgeo / geo wyrażające .-ujemne białko z niezmutowanego allelu H-Ras były również prawidłowe (dane nie pokazane). Analiza Western blot wykazała, że poziomy ekspresji onkogennego białka H-RasG12V były podobne do poziomów endogennego białka H-Ras typu dzikiego (Figura 1A), co wskazuje, że obecność kasety IRES. wpływa na ekspresję docelowego locus H-RasG12V. Figura 1Funkcjonalna charakterystyka szlaku sygnałowego H-Ras w dorosłym mózgu H-RasG12V i zarodkach E14.5. (A) Analiza Western blot poziomów ekspresji H-Ras + / + dzikiego typu i zmutowanych białek H-RasG12V. Ekstrakty białkowe (200 .g) pochodzące z okrężnic H-Ras + / +, H-Ras + / G12V, H-RasG12V / G12V i H-RasA /. myszy, jak również z mózgu (Br), serca (He), płuc (Lu), nerek (Ki) i wątroby (Li) zwierząt H-Ras + / G12V poddano analizie Western blot. W przypadku mózgu załadowano tylko jedną czwartą próbki. Migracja dzikiego typu H-Ras i zmutowanych białek H-RasG12V jest wskazywana przez groty strzałek. (B) Ekstrakty białkowe (40 .g) ze wskazanych genotypów uzyskanych z 2-miesięcznych mózgów dorosłych i całych zarodków E14.5 rozdzielono przez SDS-PAGE, przeniesiono na błonę nitrocelulozową i osuszono z przeciwciałami przeciwko H-Ras i niefosforylowane i fosforylowane formy Erk1 / 2, Mek1 i Akt. Poziomy aktywnego białka H-Ras związanego z GTP (H-Ras. GTP) określono na podstawie jego zdolności do oddziaływania z domeną wiążącą Ras c-Raf. GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. Wzór wypowiedzi. Poprzednie badania wykazały, że H-Ras jest wyrażony w większości. Jeśli nie wszystko . tkanki (29). Jednak analiza ekspresji H-Ras na poziomie pojedynczej komórki myszy H-Rasgeo ujawniła szeroki, ale nie wszędzie, wzorzec ekspresji (dodatkowe rysunki 2. 5). Sagittalne odcinki zarodków H-Rasgeo / geo midgestation (E14.5) wskazywały, że H-Ras ulegał ekspresji w większości tkanek embrionalnych. Jednakże różne poziomy aktywności g-g w różnych tkankach sugerują, że poziomy ekspresji H-Ras nie są jednolite (dodatkowa Figura 2). Dorosłe myszy wykazywały selektywny wzór ekspresji. W sercu obserwowano wybarwianie X-gal w kardiomiocytach, komórkach śródbłonka wsierdzia (Suplementowa Figura 3A) i komórkach mięśni gładkich naczyń aorty (Suplementowa Figura 3B), ale nie w mięśniu szkieletowym (Suplementowa Figura 3C). W nerce wszystkie struktury histologiczne wykazywały barwienie X-gal (Suplementowa Figura 4A). W gruczołach mlecznych stwierdzono wybarwianie X-gal w komórkach nabłonka móżdżkowo-pęcherzykowego, ale nie w komórkach nabłonka światła (Suplemental Fig. 4B). Podobnie, wszystkie warstwy nabłonka skóry, gruczołów łojowych i mieszków włosowych wykazują aktywność (3-galową (Suplementowa Figura 4C). Pęcherz moczowy wykazywał silne poziomy zabarwienia X-gal zarówno w błonie nabłonkowej błony śluzowej, jak iw komórkach mięśniowych (Supplemental Figure 4D). W trzustce zaobserwowano wybarwianie X-gal w wysepkach dokrewnych, ale nie w zewnątrzwydzielniczej trzustce (dodatkowa Figura 4E). Okrężnica wykazała równomierne wybarwienie X-gal, co sugeruje wszechobecny wzór ekspresji H-Ras (Suplementowa Figura 4F). Większość struktur mózgowych, w tym hipokamp i kora, również wykazywała silną aktywność (3-galową (Suplementowa Figura 4, G i H). Tylko móżdżek wykazywał niską aktywność. -Gal (dane nie pokazane)
[przypisy: scyntygrafia kości warszawa, wzór mdrd, archiwum allegro 2013 ]