Mysi model zespołu Costello ujawnia stan nadciśnienia z udziałem III Ang ad 9

Nie wiadomo, czy białko H-RasG12V promuje nadciśnienie poprzez zmiany w innych ośrodkach mózgu, komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych lub komórkach śródbłonka, które ostatecznie skutkują aktywacją układu reniny. Ang II. Konieczne będą dalsze prace nad identyfikacją szlaku sygnałowego i typów komórek zaangażowanych w rozwój nadciśnienia i związanych z nim patologii. Dostępność modelu zwierzęcego dla CS, jak również dla innych zespołów NCFC, może ujawnić dotychczas niewykryte usterki i pomóc w opracowaniu potencjalnie przydatnych strategii terapeutycznych. Na przykład, uważa się, że onkoproteina H-Ras, w przeciwieństwie do innych członków nadrodziny białek Ras, jest całkowicie zależna od potranslacyjnej farnezylacji aktywności biologicznej (47). Dlatego ważne byłoby ustalenie, czy hamowanie farnezylacji H-Ras przez genetyczne (przez krzyżowanie zwierząt H-RasG12V z myszami FTaselox / lox) lub farmakologiczne (przez traktowanie inhibitorami FTazy) może wyeliminować, lub przynajmniej polepszyć, CS podobne defekty obserwowano u myszy H-RasG12V (48, 49). Podobnie, myszy H-RasG12V można wykorzystać do testowania, czy inhibitory szlaku Raf / Mek / Erk lub droga PI3K / Akt mogą mieć właściwości terapeutyczne dla pacjentów z CS. Wyniki naszego obecnego badania powinny mieć znaczący wpływ na nasze zrozumienie i przyszłe leczenie CS. Metody Wytwarzanie zmutowanych myszy H-Ras. Wykorzystanie zwierząt było zgodne ze standardami opieki nad zwierzętami ustanowionymi przez Unię Europejską. Wszystkie eksperymenty zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Instytutu Zdrowia Carlosa III i Uniwersytet w Salamance. Aby celować w locus H-Ras, wygenerowaliśmy 3. Wektor kierujący H-Ras przez subklonowanie fragmentu Hindlll o długości 4,5 kbp z biblioteki genomowej 129Sv / J do pBlueScript SKII. Ten fragment DNA zawiera większość sekwencji kodujących H-Ras i 2,5 kbp z 3. nieprzetłumaczony region. Następnie, kasetę IRES. Geo (50) wprowadzono do miejsca XbaI wytworzonego przez ukierunkowaną mutagenezę 263 bp poniżej kodonu translacji stop TGA i 149 bp powyżej domniemanego miejsca poliadenylacji (Suplementowa Figura 1A). Ten wektor docelowy linearyzowano SalI i elektroporowano do komórek R1 ES (51), jak opisano wcześniej (52). Trzydzieści z 54 klonów zidentyfikowano jako rekombinanty H-Ras + / geo metodą analizy Southern blot (Suplementowa Figura 1B). Aby wygenerować 5. targetinging vector, najpierw subklonowano fragment DNA KpnI-SpeI o wielkości 4,7 kb z biblioteki genomowej 129Sv / J do plazmidu klonującego pMECA (53). Ten fragment DNA, który zawiera 3 052 pb z 5. region nieulegający translacji, eks3-3 i pierwsze 24 pz eksonu 4, zastosowano do wstawienia kasety LSL (loxP-PGK-Hyg-STOP-loxP, odnośnik 54) do miejsca Notl wygenerowanego przez ukierunkowaną mutagenezę 147 bp powyżej eksonu (dodatkowa postać 1C). Ponadto mutagenizowaliśmy środkowy nukleotyd kodonu 12 (GGA . GTA; Suplementowa Figura 1C). Ten wektor docelowy linearyzowano Eam1105I i elektroporowano do komórek H-Ras + / geo ES jak opisano powyżej. Cztery z 1552 klonów zidentyfikowano jako homologiczne rekombinanty metodą analizy Southern blot (Suplemental Fig. 1D). Spośród tych klonów 2 były negatywne dla aktywności (3-galowej, co sugerowało, że 5. Zdarzenie rekombinacji występuje w allelu H-Rasgeo. Te domniemane klony H-Ras + / LSLG12V transfekowano plazmidem kodującym rekombinazę Cre bakteriofaga, aby zapewnić, że wycięcie kasety LSL przywróciło ekspresję białka a -geo. Klony ES niosące allele H-Rasgeo i H-RasLSLG12V zastosowano do wytworzenia chimerycznych myszy przez mikroiniekcję do blastocyst C57BL / 6J. Te myszy krzyżowano z samicami C57BL / 6J w celu uzyskania linii płciowej docelowego allelu. Myszy H-Ras + / LSLG12V krzyżowano z transgenikami EIIaCre, które eksprymują Cre w stadium zygoty (55) w celu umożliwienia skutecznego rozszczepienia kasety LSL w linii płciowej (Suplementowa Figura 1E). Myszy niosące allel H-RasG12V krzyżowano z myszami C57BL / 6J w celu eliminacji transgenu EIIaCre, a następnie między sobą w celu wytworzenia homozygotycznego szczepu. Myszy utrzymywano na mieszanym podłożu 129Sv / J x C57BL / 6J i trzymano w barierze zgodnie ze standardami opieki nad zwierzętami ustalonymi przez Unię Europejską. Rutynowe genotypowanie alleli H-Ras +, H-Rasgeo, H-RasLSLG12V i H-RasG12V przeprowadzono przez amplifikację PCR (patrz Metody dodatkowe). Analiza Western blot. Aby porównać poziomy ekspresji endogennego H-Ras typu dzikiego i zmutowanych białek H-RasG12V na podstawie ich różnych ruchliwości elektroforetycznych (56), ekstrakt białka o masie 200 ug z różnych tkanek rozdzielono w 15% SDS-PAGE, przeniesiono na filtry nitrocelulozowe i inkubowane z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-H-Ras (Ras, klon 18, BD Biosciences)
[hasła pokrewne: limitki aflofarm, igor michajłowski, stomatologia na księżym młynie ]