Mysi model zespołu Costello ujawnia stan nadciśnienia z udziałem III Ang ad 10

Pierwszorzędowe przeciwciało wykrywano za pomocą poliklonalnego koziego przeciwciała przeciwko mysiej peroksydazy chrzanowej sprzężonego z peroksydazą i wizualizowano za pomocą ulepszonego układu chemiluminescencyjnego (ECL Plus, Amersham Biosciences). W celu określenia poziomów ekspresji H-Ras i jej dalszych efektorów, 40 .g ekstraktu białkowego uzyskanego z różnych tkanek rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na błonę nitrocelulozową i osuszono z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-H-Ras lub z przeciwciałami poliklonalnymi wywoływanymi przeciwko Erk1 / 2 (C-16, Santa Cruz Biotechnology Inc.), fosforylowanej Erk1 / 2 (fosforesidów Thr202 i Tyr204, technologii sygnalizacji komórkowej), Mek1 (C-18, Santa Cruz Biotechnology Inc.), fosforylowanej Mek1 (fosforydazy Ser217 i Ser221, technologia sygnalizacji komórkowej), Akt (technologia sygnalizacji komórkowej), fosforylowana Akt (fosforesidaza Ser473, technologia sygnalizacji komórkowej) i GAPDH (Sigma-Aldrich) do kontroli obciążenia. Pierwotne przeciwciała wykrywano odpowiednimi kozimi drugorzędowymi przeciwciałami przeciwko mysim lub króliczym IgG (Alexa Fluor 680, Invitrogen) i wizualizowano za pomocą systemu LI-COR (Odyssey). W celu pomiaru aktywnego białka H-Ras związanego z GTP, mg (mózg) lub 3 mg (zarodki) ekstraktów białkowych przetworzono za pomocą zestawu do testu aktywacji Ras (Cell Biolabs) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyciągnięte białko H-Ras wykrywano za pomocą analizy Western blot przy użyciu opisanego powyżej przeciwciała monoklonalnego H-Ras. Histopatologia i immunohistochemia. Zarodki lub tkanki poddano obróbce w celu analizy immunohistochemicznej, badań na całym podłożu i ekspresji p-galu, jak opisano w Metodach uzupełniających. Karcinogeneza skóry. Dziesięciodniowe myszy leczono jedną dawką DMB (Sigma-Aldrich) w dawce 25 .g, a tydzień później ekspozycją na TPA (Sigma-Aldrich) przez 24 tygodnie (12,5 .g dwa razy na tydzień). Aby zidentyfikować obecność mutacji H-Ras, genomowy DNA obejmujący eksony i 2 kodujące H-Ras (3 powielono przez PCR z DNA brodawczaka, jak opisano w Suplemental Methods. CT. Akwizycję CT wykonano za pomocą urządzenia eXplore Vista PET CT (GE Healthcare), stosując natężenie prądu 200 .A i napięcie 35 kV. Dwumiesięczne myszy znieczulono ketaminą (75 mg / kg masy ciała, Imalgene500; Merial) i ksylazyną (1 mg / kg masy ciała, Ronpum, Bayer) podczas przejęcia. Aby ocenić różnice morfologiczne u nowonarodzonych myszy, zebraliśmy zestaw 12 dwuwymiarowych punktów orientacyjnych w płaszczyźnie środkowo-czaszkowej czaszki (Dodatkowa figura 8). Konfiguracje punktów orientacyjnych zostały wyrównane poprzez translację i obrót w uogólnionej analizie Procrustes, dopasowanie najmniejszych kwadratów wszystkich konfiguracji dwuwymiarowych do średniej (57). Różnice między grupami w położeniu przestrzennym tych punktów orientacyjnych określono za pomocą testu Hotelling T2 dla każdej pary współrzędnych xy. Badania hemodynamiczne. Czteromiesięczne myszy znieczulono phentobarbitalem sodu (40 mg / kg masy ciała, Sigma-Aldrich). Ciśnienie tętnicze rejestrowano przez cewnikowanie prawej tętnicy szyjnej za pomocą sondy ciśnieniowej podłączonej do cyfrowego rejestratora danych (MacLab / 4e, AD Instruments), jak opisano wcześniej (58). Nagrania zostały następnie przeanalizowane za pomocą oprogramowania Chart version 3.4 (ADInstruments). Ciśnienie krwi i częstość akcji serca rejestrowano po 20-minutowym okresie stabilizacji po cewnikowaniu. Ciśnienie krwi i częstość akcji serca rejestrowano także u przytomnych myszy za pomocą zautomatyzowanego systemu wielokanałowego, stosując metodę tail-cuff i czujnik fotoelektryczny (Niprem 546, Cibertec SA). Stężenie Ang II i ET1 w osoczu oznaczono metodą ELISA, jak opisano wcześniej (46). Stężenia kreatyniny w moczu i osoczu określono przez modyfikację metody reakcji Jaffe (59). Stężenie elektrolitu w moczu mierzono za pomocą autoanalizatora Hitachi 917. Całkowity kolagen obecny w tkankach oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometrycznej analizy poziomów hydroksyproliny. W celu uwidocznienia zwłóknienia in situ, skrawki tkanki zatopione w parafinie zabarwiono czerwienią Sirius (Fluka). W badaniach farmakologicznych losartan (DuPont) i bosentan (Sigma-Aldrich) wstrzyknięto do lewej żyły szyjnej zwierząt (10 mg / kg masy ciała), a ciśnienie krwi mierzono w czasie rzeczywistym, jak opisano powyżej. W celu zahamowania układu Ang II, 6-tygodniowe myszy traktowano kaptoprilem (Sigma-Aldrich) dodawanym do wody pitnej (250 .g / ml) we wskazanych okresach czasu. Statystyka. W badaniach CT różnice między grupami zostały określone za pomocą testu Hotellinga T2. W badaniach dotyczących układu sercowo-naczyniowego wyniki wyrażono jako średnie. SEM. n był również wskazany. Myszy H-Ras + / G12V i H-RasG12V / G12V porównano z myszami H-Ras + / + przy użyciu testu jednostronnego ucznia
[podobne: fluomizin opinie, ekspandowany co to znaczy, centrum medyczne bazarowa ]