eskulap żary urolog

Wgłębienia do resorpcji (brązowe) wybarwiono aglutyniną pszenicy sprzężonej z peroksydazą chrzanową. Pasek skali: 100 .m. W celu ustalenia, czy niepowodzenie generowania OC było drugorzędne w stosunku do apoptozy, a nie z powodu pierwotnego efektu RelA na różnicowanie, użyliśmy inhibitora kaspazy ZVAD, w połączeniu z RANKL, podczas pierwszych 48 godzin różnicowania OC. Zabieg ten blokował indukowaną przez RANKL aktywację kaspazy-3 (Figura 3E) i znormalizował liczbę OC wytworzonych z Rela . /. prekursory po 6 dniach hodowli (Figura 3F). Znaleźliśmy również, że Rela. /. OC wytworzone w obecności ZVAD były zdolne do tworzenia resorpcyjnych dołów na kościach (Figura 3G). Te wyniki pokazują, że RelA jest ważna dla przeżycia prekursorowego OC, ale nie różnicowania ani funkcji. Szlak JNK-Bid powoduje apoptozę za pośrednictwem RANKL w nieobecności RelA. NF-kB jest zaangażowany w kontrolę wielu genów antyapoptotycznych, w tym Bcl2, BclxL i rodziny inhibitorów apoptozy (IAP) (Ciap1, -2, Xiap). Dlatego przeprowadziliśmy ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym, aby zbadać poziomy ekspresji tych potencjalnych celów RelA w prekursorach OC. Z tej grupy tylko xiap był indukowany przez RANKL w sposób zależny od RelA (Figura 4A, lewy panel). XIAP wiąże się i hamuje kaspazę-3 (17), a zatem może reprezentować ważny sygnał antyapoptotyczny kontrolowany przez RelA w odpowiedzi na RANKL w prekursorach OC. Rysunek 4 Brak RelA prowadzi do zwiększonej aktywacji JNK. (A) Pre-OC (BMM hodowane przez 2 dni z M-CSF i RANKL) generowane z Rela + / + (czarne słupki) i Rela. /. (szare słupki) myszy pozbawiono surowicy i cytokin i ponownie stymulowano RANKL przez wskazane czasy przed ekstrakcją RNA i ilościową PCR w czasie rzeczywistym dla xiap, Gadd45b i Mkp5. Rela. /. pre-OC pokazują znacznie mniejszą indukcję xiap, Gadd45b i Mkp5. * P <0,5, ** P <0,01 w porównaniu do Rela + / + w tym samym punkcie czasowym. (B) Rela + / + i Rela. /. pre-OC były głodzone i ponownie stymulowane RANKL we wskazanych czasach, a całkowite lizaty analizowano za pomocą immunoblot dla pJNK, wykazując zwiększoną aktywację JNK w Rela. /. kultury. Równoległy blot z równym obciążeniem zastosowano do oceny całkowitego białka JNK. (C) Rela + / + i Rela. /. BMM hodowano w RANKL, z lub bez inhibitora JNK SP600125 (1 .m), przez 36 godzin Apoptozę oceniono następnie za pomocą testu fragmentacji DNA. Apoptoza zależna od RANKL została zniesiona przez inhibitor JNK w Rela. /. komórki. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. . P <0,05 Rela. /. kontra Rela + / + lub Rela. /. z SP600125. (D) Rela + / + i Rela. /. BMM hodowano w warunkach osteoklastogennych przez 8 dni, z lub bez SP600125 przez pierwsze 36 godzin, wykazując uwalnianie różnicowania przy krótkotrwałym hamowaniu JNK. Pasek skali: 200 .m. W kontekście apoptozy za pośrednictwem TNF-a, brak RelA wzmaga aktywację JNK. Jeden mechanizm ulega zmniejszeniu poprzez ekspresję Gadd45a, inhibitor kinazy JKK MKK7 (18). Inni opisali zmniejszoną aktywność rodziny MKP fosfataz JNK (19). W prekursorach OC indukowana przez RANKL ekspresja zarówno Gadd45b jak i Mkp5 w sposób zależny od RelA (Figura 4A) sugeruje, że aktywacja JNK może być również zmieniona w Rela. /. Prekursory OC. Chociaż indukowana RANKL aktywacja JNK była normalna w Rela. /. BMM (dane niepokazane), Rela. /. pre-OC (BMM hodowane przez 2 dni w M-CSF i RANKL) wykazały silniejszą fosforylację JNK po głodzeniu i ponownej stymulacji RANKL przez 15 minut (Figura 4B) i zwiększoną aktywność kinazy JNK (dane nie przedstawione). Aby ustalić, czy ta wzmocniona aktywacja JNK jest związana z apoptozą w pre-OC, to leczymy Rela. /. hodowle z inhibitorem JNK SP600125, wraz z RANKL przez 36 godzin. Hamowanie fragmentacji DNA zredukowanej przez JNK do poziomów typu dzikiego (Figura 4C) i przywróconą osteoklastogenezę w Rela. /. prekursory (Figura 4D), co sugeruje, że JNK jest mechanicznie zaangażowany w apoptozę indukowaną RANKL w prekursorach OC z niedoborem RelA. Zwiększona aktywacja JNK wydaje się inicjować apoptozę przez aktywację Bid, proapoptotycznego członka Bcl-2 tylko z rodziny Bcl-2, co najmniej w odpowiedzi na TNF (20). Podczas gdy stawka została wyrażona w obu Rela + / + i Rela. /. Kultury BMM, poziomy nie były zależne od traktowania RANKL w żadnym z genotypów (Figura 5A) i produkty cięcia nie zostały wykryte [więcej w: amarantus ekspandowany co to znaczy, scyntygrafia kości warszawa, cladosporium objawy alergii ]