dioptria cylinder

Replikację niekompetentnego supernatantu wirusa dodawano do BMM przez 24 godziny, razem z 4 .g / ml polibrenu (Sigma-Aldrich), przed selekcji blastocydiną (1 .g / ml) przez 3 dni. Przetrwałe, poddane transdukcji BMM hodowano następnie w podobny sposób jak pierwotne, niemanipulowane BMM. siRNA dla Bid zostały zaprojektowane przy użyciu strony internetowej Dharmacon (http://www.dharmacon.com/DesignCenter) i sklonowane jako mała spinka do wektora retrowirusowego pSuper zawierającego promotor U6. Sekwencja SiBid1 pochodzi z 3. region nieulegający translacji to 5-CAGCTTGAGTGTATCTGAA-3; Sekwencja SiBid2 pochodząca z otwartej ramki odczytu to 5a-GCTCTGGCTGTACTCGCCA-3 .. Komórki pakujące PlatE transfekowano, a BMM transdukowano tak jak dla wektorów PMX, ale z selekcją puromycyny (2 ug / ml), a poziomy ekspresji dla BID analizowano metodą western blot. Analiza immunoblotów. Całkowite białko ekstrahowano zgodnie z opisem (8). Białka oznaczono ilościowo za pomocą zestawu do oznaczania białka DC (Bio-Rad), a 40. 50. G całkowitego białka rozdzielono przez elektroforezę żelową SDS-poliakryloamidu w warunkach redukujących, a następnie przeniesiono na membranę PVDF. Bloty inkubowano przez godzinę w 5% mleku w proszku, a następnie przez noc ze specyficznymi przeciwciałami dla pJNK, całkowita JNK (Cell Signaling); RelA, RelB, c-Rel, SP1, P-aktyna (Santa Cruz Biotechnology Inc.); lub Bid (R & D Systems); a następnie przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z króliczymi lub przeciwciańcowymi HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Bloty oceniano za pomocą chemiluminescencji przy użyciu substratów SuperSignal (Pierce) i obrazowano za pomocą Genesnap, stosując Syngene Imaging System (Synoptics). Względną ekspresję białka określono przy użyciu Genetools (Synoptics). Test B z pulldown. Ekstrakt jądrowy (30 .g) inkubowano z pokrytymi streptawidyną perełkami agarozowymi wstępnie inkubowanymi biotynylowanym oligonukleotydem (3) B3 przez 30 minut w 4 ° C na rotatorze w 1x buforze wiążącym (30 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, mM EDTA, 5% glicerolu, mg / ml BSA i mM DTT) z .g poli dIdC. Kulki następnie przemywano 1x buforem do wiązania 3 razy przed SDS-PAGE i poddawano immunoblottingowi dla RelB i / lub c-Rel. Real-time PCR. Całkowite RNA wyekstrahowano za pomocą RNeasy (QIAGEN), a cDNA wytworzono za pomocą AMV-RT (Fisher) według producentów. instrukcje wykorzystujące .g całkowitego RNA i startery oligo-dT rozcieńczone do końcowej objętości 100 .l. Ilościowy RT-PCR przeprowadzono w systemie Real-Time PCR ABI7300 (Applied Biosystems), stosując test SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Standardowa krzywa wykorzystała serię podwójnych rozcieńczeń plazmidu dla każdego genu i cDNA GAPDH. Reakcję amplifikacji prowadzono przez 40 cykli z denaturacją w 95 ° C przez 10 minut, a następnie przez odprężanie w 95 ° C przez 15 sekund, i wydłużanie i wykrywanie w 60 ° C przez minutę. Względną ilość RNA każdego transkryptu genu docelowego znormalizowano względem kontroli endogennego genu i obliczono jako 2 (ct (endogenny gen kontrolny genu docelowego), gdzie ct reprezentuje cykl progowy dla każdego transkryptu. Startery są następujące: Gapdh, 5. -CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3. i 5a-GACGGACACATTGGGGGTAG-3 .; Xiap, 5a-TGCAAGAGCTGGATTTTATGC-3. i 5a-GGTCTTCACTTGGCTTCCAAT-3 .; Gadd45b, 5. -TACGAGGCGGCCAAACTGATGAAT-3. i 5a-ACGACTGGATCAGGGTGAAGTGAA-3 .; Mkp5, 5a-GAGAAAGGCCTCTTCAACTACAA-3. i 5-CCACACTGGTGAGCTTCCTC-3 .. Statystyka. Dane przedstawiono jako średnie. SEM. Istotność statystyczną określono za pomocą dwustronnego testu dla ucznia za pomocą SigmaPlot (SSPS). Wartości P. 0,05 uznano za znaczące. Podziękowania Dziękujemy firmie D. Baltimore (California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornia, USA) za Rela. /. myszy i Crystal Idleberg do specjalistycznej histologii zwierząt. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health AR47846, CA103035 i AR52705 (na DV Novack); i AR52921 (do R. Faccio). Dodatkowe wsparcie pochodziło od Fundacji Arthritis (do R. Faccia). Przypisy Niestandardowe stosowane skróty: BMM, makrofagi szpiku kostnego; CTX, telopeptyd C-końcowy kolagenu; IKK, I.B kinaza; MTT, bromek 3-4, 5-dimetylotiazol-2y-2,5 difenylotetrazoliowy; Kinaza indukująca NIK, NF-PB3; OC, osteoklast; RC, chimera promieniowania; Receptor TNF1, p55 TNF; TRAP, kwasowa fosfataza oporna na winian. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.118: 2088. 2097 (2008). doi: 10.1172 / JCI33392
[więcej w: citodent kielce, naclof, fluomizin opinie ]